La prueba de sgRNA que se está desarrollando en el Laboratorio de Genómica PUCP continúa en fase de validación. Esta fase de validación clínica inicial nos permite obtener mediciones de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN). La prueba consiste en explotar la presencia de intermedios moleculares que se generan durante el proceso de replicación del genoma viral. Dado que estos intermedios sólo están presentes cuando el virus se replica activamente, podemos desarrollar pruebas de sgRNA que diferencian entre el estado contagioso (cuando hay replicación viral) y el no contagioso (cuando no hay replicación viral). Por ello, el objetivo de la prueba es validar prueba(s) de sgRNA en pacientes con infección por SARS-CoV-2 para determinar infección activa y diferenciar estado contagioso del no contagioso. Para estimar la sensibilidad y especificidad de la prueba en contraste con el gold-standard (RT-PCR), se utilizará un diseño transversal con muestras archivadas en el laboratorio de enfermedades respiratorias del INS. Al contrastar la prueba de sgRNA con los resultados del gold standard se obtendrá la sensibilidad de la prueba. Asimismo, se utilizarán muestras de enfermedades respiratorias (que no sean causadas por SARS-CoV-2) que hayan sido diagnosticadas antes para determinar la especificidad de la prueba. Con el objetivo de determinar el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) de la prueba de sgRNA comparada con el gold-standard (RT-PCR) y cultivo en una cohorte de pacientes con SARS-CoV-2, requiere el uso de las pruebas en un entorno clínico donde no se conoce el estado infeccioso de los pacientes. El diseño del estudio es prospectivo para estimar el período según el cual las pruebas de sgRNA son relevantes en el tiempo y con ello calcular el VPP y VPN de la misma en pacientes con SARS-CoV-2. Sin embargo, para este objetivo específico también se requiere el cultivo de las muestras de los pacientes porque se postula que el gold standard (RT-PCR) detectará los restos de ARN indistintamente de si el virus está vivo o no. Es decir, aun cuando el paciente ya no sea infeccioso, las pruebas de RT-PCR tradicionales siguen dando positivo. Para poder diferenciar entre estado infeccioso y no infeccioso, es necesario cultivar las muestras para ver si se puede aislar virus vivo o no. Esta parte del estudio requiere de bioseguridad nivel 3 (BSL-3) por lo cual se realizará por nuestros colaboradores y co-investigadores en el INS. El estudio también busca contrastar las características de la prueba de sgRNA con el gold-standard (RT-PCR) de acuerdo al tipo de muestra utilizada: hisopado nasofaríngeo y saliva. Para ello, se utilizarán muestras clínicas que permitirá contrastar los resultados obtenidos de manera prospectiva por ambos tipos de muestras. La metodología para este esfuerzo será la basada en técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS por sus siglas en ingles). El Laboratorio de Genómica tiene mucha experiencia con esta tecnología, inclusive habiendo desarrollado métodos para secuenciar varios genomas virales, incluyendo genomas de SARS-CoV-2. En breve, se hará una amplificación dirigida que amplificara secuencias virales de manera preferencial, limitando el procesamiento bioinformático que se requiere más adelante. Para el ensamblaje de la data genómica se usaran herramientas de ensamblaje de-novo y por referencia.