Objetivos: ? Optimizar el PCR para el gen rpoB. ? Estandarizar los parámetros del ELISA como: Diferentes Temperaturas de Hibridación, Diferentes rigurosidades del Buffer de Hibridación, Concentración de Estreptavidina, Concentración de Sonda, Concentración de Producto de PCR y Concentración de Conjugado en el ELISA ? Evaluar la sensibilidad y la especificidad del ELISA para para la detección de las mutaciones: H445Y, H445D y S450L asociadas a la resistencia a RIF. ? Evaluar la capacidad del PCR-ELISA para detectar la resistencia a RIF en muestras de esputo (Ensayo Piloto). Materiales Para la estandarización de la técnica de PCR-ELISA; se utilizara el ADN de las siguientes cepas: ATCC N° 27294 pansensible (H37Rv), la cual será utilizada como control sensible a todas las drogas; ATCC N° 35838 con resistencia a RIF, será utilizada como control para la resistencia a RIF en la posición S450L y 2 cepas de Myycobacterium tuberculosis en medio de cultivo Lowenstein-Jensen que serán usadas como control para las mutaciones H445D y H445Y con resistencia a RIF. Para el ensayo piloto del sistema PCR-ELISA, se considerara lo siguiente: Determinación de la línea de corte (CUT OFF): Se realizará utilizando 15 muestras de esputos de pacientes con tuberculosis(TB), sensible a las drogas anti-TB además de la cepa pansensible (H37Rv).Estas mueestras serán diagnosticadas previamente utilizando GenotypeMDRTBplus. Evaluación Piloto: Se utilizará 20 muestras de esputo, con resultaado de resistencia evaluados previamente por GenotypeMDRTBplus. Al finalizar el ensayo piloto del PCR-ELISA los resultados obtenidos de ambas técnicas seran comparados para analizar el grado de concordancia entre ellas. Para el desarrollo del presente estudio serán utilizados los siguientes equipos: 1. Termociclador 2. Cámara de Electroforesis horizontal 3. Horno de Hibridación 4. Analizador Genético de la Marca Applied Biosystems modelo 3500XL 5. Baño maría (Incubadora) de la marca Grant Instruments Procedimiento: Consistirá de 2 partes: La estandarización de la técnica y la evaluación piloto. Para ambos procedimientos, se utilizarán dos cepas control: H37Rv (pansensible) y una cepa ATCC N°35838 resistente a RIF. Los resultados finales serán analizados luego de descubrir los datos ciegos. Para la estandarización de la técnica de PCR-ELISA; se utilizará el ADN de las siguientes cepas provenientes del Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias del INS. 1. a Estandarización del PCR: Se establecerá una metodología de PCR que amplifique la región rpoB donde se localicen las mutaciones de resistencia para RIF. Se estandarizarán los diferentes parámetros como: La temperatura de annealing de los primers, concentración de cloruro de magnesio y concentración de primers. 1.b Estandarización de un ELISA: Se evaluará y diseñará una metodología de ELISA clásico para la detección de resistencia a RIF. Se evaluarán los siguientes parámetros: Concentración de Estreptavidina en placa, concentración de sonda de las mutaciones asociada a los codones H445D, H445Y y S450L, las cuales son las más frecuentes en el Perú, la temperatura de hibridación adecuada entre la sonda y el producto de PCR, concentración de conjugado, la utilización de los búferes de bloqueo y lavados de rigurosidad, la utilización de la solución de revelado más apropiada. Se utilizarán controles para cada sonda de mutación a ser evaluada, para saber a qué mutación corresponden. Una vez establecida la metodología se evaluará el PCR-ELISA en una evaluación piloto. 2. Evaluación Piloto Se realizará con las 20 muestras de esputos del laboratorio de Micobacterias del INS, a los cuales se le extraerá el ADN, según el protocolo de extracción de ADN con Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Una vez realizada la extracción de ADN, se evaluará el PCR- ELISA, y se compararán los resultados de la técnica con los resultados obtenidos por Genotype MDTBRplus, para evaluar el desempeño de la técnica.